VIVOS VOCO: А.С. Спирин, "ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА И ПРОБЛЕМЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ"

А.С. Спирин

ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА
И ПРОБЛЕМЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

Доклад на совместном Общем собрании Российской академии наук и Российской академии медицинских наук

Спирин Александр Сергеевич - академик, зав. каф. молекулярной биологии МГУ, советник РАН.

Человечество вошло в третье тысячелетие с громадными знаниями в области наук о жизни и колоссальным потенциалом их практического использования. Путем манипулирования молекулами ДНК и РНК современный человек может произвольно и направленно изменять наследственность окружающего его живого мира - бактерий, растений, животных и человека. Это открывает беспрецедентные возможности для технологического прогресса (биотехнология и биоинженерия) и революционных прорывов в медицине (генная терапия) и сельском хозяйстве (трансгенные, или генетически модифицированные, растения и животные). Вместе с тем - и в связи с этим - биологическая безопасность становится одной из главных проблем человечества в наступившем тысячелетии.

Опасности, исходящие из прогресса биологической науки, в первую очередь молекулярной биологии и ее практических применений, таких как генная и белковая инженерия, генная терапия, молекулярное управление развитием, разнообразны. Перечислю лишь некоторые, кажущиеся сегодня наиболее опасными, направления научной и практической деятельности человечества в этой области.

• Создание новых рекомбинантных генов, ранее отсутствовавших в природе, и прогрессирующее распространение трансгенных, или генно-модифицированных организмов (организмов с чужеродными генами), используемых в качестве сельскохозяйственных культур и пород, а также в микробиологической промышленности. Потенциальная опасность заключается в возможности неконтролируемого распространения новых видов и генов, нарушающих природное равновесие и живые системы. Еще более серьезную опасность представляет создание методологии для манипулирования человеческой наследственностью.
• Развитие генной терапии. Прогресс в лечении симптомов наследственных дефектов без искоренения самих дефектных генов, как это предполагается всей стратегией генной терапии, будет неизбежно приводить к накоплению вредных генов в человеческой популяции и, следовательно, к деградации генофонда в будущем. Кроме того, человечество ожидает геронтологический кризис. Наконец, генная терапия создает высокотехнологичную методологию для разработки и применения биологического оружия нового поколения.
• Прямая, преднамеренная разработка новых видов биологического оружия, в первую очередь вирусного, токсинного и генного. Нельзя не учитывать такие особенности этого оружия, как исключительная массовость поражения при скромности финансовых затрат и производственных мощностей для его создания, возможность скрытного производства и применения, возможность как отсроченного эффекта, так и чрезвычайно быстротечного действия. Особенно опасным может быть групповой и индивидуальный терроризм с применением биологического оружия. Проблема состоит в том, что все достижения и технологические разработки генной инженерии, генной терапии и других направлений биотехнологии и биоинженерии могут быть непосредственно и прямо использованы для создания биологического оружия нового поколения.

ТЕРРОРИЗМ И БИОТЕРРОРИЗМ

Вступление человечества в новое тысячелетие оказалось сопряженным с осознанием того, что международный, глобальный терроризм, по-видимому, будет представлять собой постоянную угрозу XXI в. Эта угроза может включать в себя и скрытый терроризм со стороны некоторых стран, и индивидуальный и групповой терроризм религиозных сект, и патологический терроризм самоубийц и психопатов. Все развитие современной цивилизации предоставляет ранее невиданные технические возможности для широкомасштабного терроризма. Особую опасность глобального характера несет в себе биотерроризм. Развитие молекулярной биологии и биотехнологий приводит к осознанию неизбежности этого вида терроризма в ближайшем будущем и, следовательно, к необходимости создания как глобальной, так и национальной стратегии защиты.

К сожалению, до настоящего времени преобладающая часть дискуссий относительно стратегии биозащиты сфокусирована на существующих угрозах от применения избранной группы известных природных патогенов (бактерий и вирусов) и токсинов. Однако сейчас уже необходимо говорить о трех поколениях потенциального биологического оружия [1].

Традиционные патогены — это первое поколение биооружия, разрабатывавшегося с конца 1930-х-начала 1940-х годов при-плизительно до 1970 г., то есть до начала биотехнологической революции. Сюда относятся особо опасные бактериальные инфекции, такие как чума. холера, сибирская язва; вирусные инфекции - натуральная оспа, неизлечимые геморрагические лихорадки, "медленные", задержанные или латентные, активируемые инфекции; мощные белковые токсины бактериального и растительного происхождения - дифтерийный токсин, холерный токсин, рицин и т.п.

Второе поколение - это генетически модифицированные патогены, создание которых стало возжным на основе современных методов молекулярной биологии и биотехнологии, разработанных в основном в период с 1980 г. до конца прошлого тысячелетия. Бактерии, устойчивые к антибиотикам, бактерии и вирусы повышенной патогенности, устойчивые во внешней среде и в аэрозолях, с измененными антигенными свойствами, что делает невозможной защиту от них с помощью вакцинации и естественного иммунитета, - типичные представители этого второго, "продвинутого" поколения.

Расшифровка человеческого генома и самые последние успехи молекулярной и клеточной биологии привели к возможности создания биологического оружия третьего, "постгеномного", поколения XXI в. - генного и другого молекулярного оружия (в международной литературе обозначается как Advanced Biological Warfare - сокращенно ABW) [1]. В арсенал этого оружия входят:

гены, то есть молекулы ДНК, проникающие в организм и кодирующие вредные белки, такие как белковые токсины, белки-репрессоры, подавляющие важнейшие функции человека, регуляторы функций, активаторы малигнизации, ингибиторы иммунитета;
малые регуляторные РНК (siRNA и miRNA), проникающие в организм и избирательно выключающие синтез функционально важных белков в организме;
прионы - инфекционные белки, нарушающие процессы образования пространственной структуры функционально важных белков.

Этот список грозит пополняться с каждым годом.

С особой силой следует подчеркнуть, что возможность создания биологического оружия третьего поколения означает смену парадигмы. Это - принципиально новый класс агентов, искусственно сконструированных на основе знаний человеческого генома и протеома для атаки специфических биологических систем человека - кардиологической, иммунологической, неврологической, гастроэнтерологической и т.д. - на молекулярном уровне. Планируемые эффекты от воздействия молекулярного оружия - смерть, инвалидность, нервные и психические расстройства, дебилизация ("манкуртизация"), стерилизация.

НАУЧНЫЕ КОРНИ МОЛЕКУЛЯРНОГО
БИОЛОГИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ

Принципиальная возможность существования в природе и искусственного создания молекулярных патогенов, то есть индивидуальных инфекционных молекул (в дополнение к ранее известным клеточным и субклеточным патогенам типа бактерий и вирусов), была открыта давно, еще в середине прошлого - XX - столетия. В 1944 г. О.Т. Эйвери с коллегами показал, что ДНК, выделенная в чистом виде из капсулированной формы пневмококков типа III, может проникать в клетки некапсулированной формы пневмококков типа II и, воспроизводясь в последних, трансформировать их в капсулированные клетки типа III [2].

Так была обнаружена наследственная трансформация клеток с помощью молекул ДНК. Трансформированные пневмококки стали, по существу, первым трансгенным организмом, полученным в эксперименте (см. мой обзор [3]).

Эти же опыты впервые указали на потенциальную возможность инфекционности изолированной ДНК. Череч несколько лет А.Д. Херши и М. Чейз доказали, что и при естественном заражении клетки вирусом (на примере заражения бактерии бактериофагом) именно молекула ДНК входит в клетку и является инфекционным началом [4]. Еще через четыре года А. Гирер и Г. Шрамм, выделив чистую РНК из вируса табачной мозаики и введя ее в клетки растения, вызвали такое же их заражение, как и в случае целого вируса, прямо и окончательно доказав потенциальную инфекционность изолированных нуклеиновых кислот [5]. В настоящее время разрабатываются методы искусственной стабилизации молекул ДНК и РНК и повышения их способности проникать в клетки высших организмов, включая человека. Расширяющаяся практика так называемой ДНК-вакцинации - тому пример. Проникающие гены - инфекционные молекулы нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) - могут стать мощным молекулярным оружием нового поколения.

С этой точки зрения следует по-новому взглянуть и на возможность случайного заражения чужеродным генетическим материалом через окружающую среду. Некоторое время тому назад группой члена-корреспондента РАН А.Б. Четверина в Институте белка РАН были разработаны методы "выращивания" колоний (клонов) молекул РНК и ДНК на твердых средах, содержащих РНК-полимеразу или ДНК-полимеразу, из индивидуальных молекул РНК или ДНК соответственно [6-8]. Эта уникальная техника позволяет обнаружить в среде единичные молекулы генного материала и может быть основой для самой чувствительной и точной диагностики инфекционных генов и структур, их содержащих. Первые же опыты по выращиванию молекулярных колоний из молекул нуклеиновых кислот, попадающих на твердую среду чашки Петри из воздуха, показали, что различные гены и их фрагменты присутствуют в воздухе, которым мы дышим!

Другую, еще более коварную группу молекулярных патогенов может составить открытый совсем недавно класс регуляторных микроРНК, которые не кодируют никаких белков, но оказывают мощное подавляющее действие на активность жизненно важных генов живых организмов. Еще два десятилетия назад для целей экспериментальной избирательной блокировки экспрессии генов клеток и организмов было предложено вводить в них так называемые антисмысловые РНК - сравнительно короткие нуклеотидные последовательности, комплементарные функционально важным участкам матричной РНК (мРНК), продуцируемым этими генами (см., например, [9]). Позднее было обнаружено, что короткие синтетические двухспиральные РНК, одна из цепей которых комплементарна любому участку гена-мишени и, соответственно, его мРНК, оказывает еще более мощный эффект, полностью и строго избирательно инактивируя экспрессию данного гена в клетках животных [10, 11], включая млекопитающих [12]. Это явление получило название РНК-интерференции и оказалось присуще также и механизмам эндогенной регуляции экспрессии генов, по-видимому, у всех эукариотических организмов [13,14].

Наконец, целый новый мир микроРНК, или малых временных РНК (small temporal RNA), остававшийся не замеченным учеными в течение многих лет, предстал перед нами в качестве широко распространенного и "обычного" регулятора генной активности в процессах развития и клеточной дифференцировки у высших организмов [15-17]. МикроРНК - это нуклеиновые кислоты совсем крошечного, даже по молекулярным масштабам, размера - длиной всего 20-25 нуклеотидных остатков (молекулярный вес около 6000-7000). Они способны направленно выключать экспрессию жизненно важных генов через взаимодействие с нетранслируемой областью их мРНК. Синтез микроРНК в искусственных условиях не представляет проблем, а их стабилизация и доставка в клетки и организмы, ввиду малых размеров, будет, по-видимому, делом несложной техники.

Молекулярными патогенами совсем другой природы являются прионы - инфекционные белковые молекулы, хотя и не размножающиеся сами в организме хозяина, но вызывающие прогрессирующую перестройку белков хозяина "на свой манер", - их аггрегацию и медленную неизбежную смерть организма [18-20]. Человечество уже реально сталкивается с опасностями, связанными с прионными заболеваниями скота и самого человека.

ПУТИ ПРОТИВОДЕЙСТВИЯ БИОТЕРРОРИЗМУ

Целый ряд особенностей биологического оружия нового поколения - молекулярного биологического оружия - имеет уникальный и беспрецедентный характер. Ниже следует список этих особенностей.

• Низкая стоимость разработок, возможность создания силами одной небольшой лаборатории с двумя-тремя высококвалифицированными специалистами-биотехнологами.
• Громадный эффект воздействия: один грамм вещества может содержать от одного до ста квинтиллионов (10¹⁸-10²⁰) активных молекул патогена, и если это молекулы амплифицирующихся РНК или ДНК, каждая молекула, попавшая в организм, будет размножаться и заражать окружающие особи (в последнем заключается принципиальное отличие от химического оружия).
• Обход иммунологических барьеров организма и специфических вакцинаций.
• Необычная клиническая картина, трудность диагностики.
• Бессилие традиционных лекарств и методов лечения.
• Отсутствие материальных разрушений.
• Возможность скрытных разработок.
• Возможность скрытного применения.
• Возможность отсроченного эффекта.
• Возможность избирательного воздействия на определенную популяцию (путем использования генетических, климатических и культурных особенностей рас, наций, народностей).

Перечисленные особенности создают исключительно серьезные трудности в решении проблем, связанных с противодействием биологическому терроризму.

Проблема предотвращения разработки и производства оружия. Это практически не разрешимая проблема. Во-первых, программы таких разработок трудно отличимы или вовсе не отличимы от легитимных научных исследований. Во-вторых, используемые методы и техника не отклоняются от стандартных биотехнологических протоколов; фактически все современные методы молекулярной биологии, генной инженерии и биотехнологии могут быть квалифицированы как "двойные технологии". В-третьих, необходимое оборудование, материалы и реактивы легкодоступны на рынке научного и биотехнологического оборудования. В-четвертых, как уже говорилось, разработкой и производством может сниматься совсем небольшая группа, внешне никак себя не обнаруживающая.

Проблема нераспространения. Чрезвычайная легкость распространения технологии производства биологического оружия нового поколения и самого оружия вызывает все большую тревогу специалистов и общества [1]. Прежде всего эта легкость обеспечивается доступностью научной, методической и технической информации в открытых публикациях, базах данных, на международных симпозиумах. Легкому распространению способствуют потоки иностранных студентов и стажеров через исследовательские лаборатории, снижение технических и квалификационных барьеров ввиду все большего использования детальных (рассчитанных "на дурака") описаний и протоколов генноинженерных и биотехнологических процедур, продажных стандартных наборов реагентов (так называемых "китов") и т.п. Наконец, нельзя забывать о возможностях "дигитального распространения" агентов биологического оружия (например, химический синтез любого патогенного гена или вируса по его нуклеотидной последовательности, имеющейся в компьютерной базе данных [21]).

Проблема обнаружения в окружающей среде и нахождения источника молекулярного патогена, а также серия проблем диагностики, профилактики и лечения. Следует помнить, что в данном случае медики столкнутся с нестандартными и неизвестными агентами, для которых не существует ни разработанных тестов для обнаружения и диагностики, ни методов воздействия на агент в среде и в организме. Это диктует необходимость создания системы мер нового поколения, основанных на прогрессе молекулярной биологии как фундаментальной науки. Обнаружение и диагностика окажутся невозможными без разработки новых подходов для быстрой идентификации типа инфекционного агента, лежащей в его основе молекулы и ее структурной характеристики. На повестке дня стоит создание автоматической генерализованной диагностической системы с идентификацией генной принадлежности агента (для чего требуется иметь в базе данных геном человека и геномы всех микробов и вирусов!) [1].

Частичное решение проблем профилактики и лечения может состоять в разработке новых подходов к иммунизации и, в частности, нахождении путей "множественной" иммунизации, таких как стимуляция В-лимфоцитов синтетическими полимерами, осуществленная в совместной работе академика В.А. Кабанова, академика Р.В. Петрова и академика РАМН P.M. Хаитова [22]. Поиск альтернативных путей повышения устойчивости человека к инфекционным агентам, например модуляция цитокиновой сети [23], может стать новым стратегическим направлением в противодействии молекулярным инфекциям. Создание методов генной терапии с помощью РНК-интерференции и микроРНК также требует самого пристального внимания.

Итак, биологические опасности современного мира, в том числе биологическое оружие нового поколения, базируются на новейших достижениях биологических наук и биотехнологий. Способы сознательного использования этих достижений во вред человечеству, как и пути неконтролируемого развития биологических катастроф, непредсказуемы или предсказуемы лишь приблизительно. Следовательно, меры противостояния -биологическая безопасность - требуют, во-первых, знания молекулярных механизмов действия потенциально опасных агентов и, во-вторых, способности быстрого использования этих знаний для практического реагирования в конкретной ситуации, то есть высокоразвитой фундаментальной науки. Таким образом, поддержание высокого уровня фундаментальной науки - абсолютно необходимое условие противостояния распространению биологических опасностей в современном мире.

ЛИТЕРАТУРА

1. Petro J.B., Plasse T.R., McNulty J.A. Biotechnology: Impact on biological warfare and biodefense // Biosecurity and Bioterrorism. 2003. V. 1. P. 161-168.

2. Avery O.T., MacLeod CM., McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation ofpneumococcal types. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneu-mococcus type III // J. Exp. Med. 1944. V. 79. P. 137-158.

3. Спирин А .С. Современная биология и биологическая безопасность // Вестник РАН. 1997. № 7.

4. Hershey A.D., Chase M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage // J. Gen. Physiol. 1952. V. 36. P. 39-56.

5. Gierer A., Schramm G. Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus // Nature. 1956. V. 177. P. 702-703.

6. Chetverin A.B., Chetverina H.V., Munishkin A.V. On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qp replicase // J. Mol. Biol. 1991. V. 222. P. 3-9.

7. Chetverina H.V., Chetverin A.B. Cloning of RNA molecules in vitro. Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 2349-2353.

8. Четверин А.Б., Четверина Е.В. Точная диагностика с помощью молекулярных колоний // Молекулярная биология. 2002. Т. 36. С. 320-327.

9. lzant Y., Weintrauh H. Inhibition of thymidine kinase gene expression by anti-sense RNA: a molecular approach to genetic analysis // Cell. 1984. V. 36. P. 1007-1015.

10. Fire A., Xu S., Montgomery M.K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. V. 391. P. 806-811.

11. Montgomery M.K., Xu S., Fire A. RNA as a target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 15502-15507.

12. Wianny F., Zernicka-Goets M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development // Nature Cell Biol. 2000. V. 2. P. 70-75.

13. Aravin A .A., Naumova N.M., Tulin A.V. et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline // Current Biol. 2001. V. 11. P. 1017-1027.

14. Аравин A.A., Кленов М.С., Вагин В.В. и др. Роль двухцепочечной РНК в подавлении экспрессии генов эукариот // Молекулярная биология. 2002. Т. 36. С. 240-251.

15. Lagos-Quintana M., Rauhut R., Lendeckel W., Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs // Science. 2001. V. 294. P. 853-858.

16. Lau N.C., Lim L.P., Weinsfein E.G., Bartel D.P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans // Science. 2001. V. 294. P. 858-862.

17. Lee R.C., Amhros V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans // Science. 2001. V. 294. P. 862-864.

18. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie // Science. 1982. V. 216. P. 136-144.

19. Prusiner S.B. Molecular biology ofprion diseases // Science. 1991. V. 252. P. 1515-1522.

20. Cohen F.F., Pan К .-M., Huang Z. et al. Structural clues to prion replication // Science. 1994. V. 264. P. 530-531.

21. Cello J., Paul A.V., Wimmer E. Chemical synthesis of poliovirus cDNA: Generation of infectious virus in the absence of natural template // Science. 2002. V. 297. P. 1016-1018.

22. Кабанов В.А. От синтетических полиэлектролитов к полимер-субъединичным вакцинам // Высокомолекулярные соединения. Серия А. 2004. Т. 46. С. 759-782.

23. Margolis L. Cytokines - strategic weapons in germ warfare? //Nature Biotechnology. 2003. V. 21. P. 15, 16.