VIVOS VOCO: Т. Филатова, "Вакцина против менингита"

ВАКЦИНА ПРОТИВ МЕНИНГИТА

Т.Н. Филатова

С НАЧАЛА первой вакцинации против оспы (1796) и до нашего времени созданы вакцины с целью профилактики всего лишь 22 болезней, из них девять - для детей, а 13 - для взрослых в группах повышенного риска. По прогнозам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), в ближайшие десять лет должны появиться новые вакцинные препараты еще для 28 заболеваний. Во второй половине XX в. начался активный поиск и в создании эффективной вакцины против менингококкового менингита. По числу смертельных исходов эта форма менингита лидирует среди других инфекционных заболеваний: погибает каждый пятый больной. Вызывают инфекцию менингококки (Neisseria meningitidis) - парные бобовидные бактерии размером 6 - 8 мкм. Это так называемые грамотрицательные диплококки. Впервые этот микроорганизм выделил из спинномозговой жидкости и довольно подробно изучил в 1887 г. венский медик А.Вейксельбаум. Как построена клетка менингококка? Она покрыта капсулой, которая состоит из молекул полисахарида. Под капсулой расположена клеточная стенка бактерии, образованная белками, липополисахаридами и липидами. На поверхности клеточной стенки у свежевыделенных штаммов культуры менингококка можно разглядеть "реснички", состоящие из молекул белка (пили). Далее следует слой пептидогликана, а за ним - цитоплазматическая мембрана.

Удивительно, что возбудитель столь страшной болезни - очень "нежный" микроб: он погибает через 10 мин при температуре окружающей среды 60^oС, а при 80^oС его гибель наступает через 2 мин. Прямой солнечный свет убивает его за 2 - 8 ч, а под действием ультрафиолетовых лучей менингококки погибают почти мгновенно. Столь же чувствительны они и к действию низких температур, а также - присутствию некоторых химических веществ, например фенола: добавление его 1%-го раствора приводит к гибели микробной культуры через 1 мин. Но этот "нежный" и "чувствительный" микроб достаточно быстро приспосабливается к воздействию лекарственных препаратов. В 30 - 50-х годах нашего столетия первыми высокоэффективными препаратами, которые использовались для лечения менингита во всем мире, были сульфаниламиды. Однако уже через 20 лет менингококки приобрели устойчивость к их действию. Сейчас для эффективного лечения менингококкового менингита в основном используют антибиотики, хотя и к ним у возбудителей вырабатывается резистентность. Так, например, если в 60-х годах все штаммы менингококка погибали от действия тетрациклина, то через 10 - 12 лет чувствительными к нему остались лишь 20% штаммов. Аналогичная ситуация складывается и с пенициллином и его синтетическими аналогами. Врачам приходится вводить больным препараты этих антибиотиков в высоких концентрациях, а также использовать новые мощные лекарственные формы антибиотиков, еще незнакомые микробам.

ЗАРАЖЕНИЕ И ЗАЩИТА ОРГАНИЗМА

Менингококки - не только "нежные", но и "разборчивые" микробы: в качестве хозяина они выбирают исключительно человека, в естественных условиях животные к ним невосприимчивы. Распространение возбудителя происходит воздушно-капельным путем. Попав на слизистую оболочку носоглотки и размножившись там в достаточном количестве, менингококк проникает в лимфатические сосуды, кровь и, наконец, при остром течении заболевания, в мозговые оболочки человека, вызывая тяжелейшее гнойное воспаление головного мозга. Но тяжелая форма менингита развивается не у каждого носителя, а лишь у тех, у кого ослаблен иммунитет, например, за счет ранее перенесенных заболеваний, неполноценного питания и т.д.

В ответ на появление в организме антигенов болезнетворных микробов, которые находятся на их поверхности, вырабатываются специфические антитела - иммуноглобулины (Ig). Для менингококков известны три типа поверхностных антигенов: полисахариды, из которых построена капсула, липополисахариды и белки, входящие в состав наружной клеточной стенки возбудителя.

ПОЛИСАХАРИДНЫЕ ВАКЦИНЫ

У больных менингококковым менингитом было обнаружено повышенное содержание специфических антител к капсульному полисахариду (они принадлежали к IgM классу). Возникло предположение, что именно эти антитела могут обеспечивать защиту от инфекции. Поэтому первые вакцинные препараты против менингококковой инфекции были сконструированы на основе капсульного полисахарида.

По антигенному составу менингококки разделяются на 12 серогрупп, определяемых специфичностью капсульного полисахарида (A, B, C, X и т.д.). Полисахарид серогруппы А представляет собой полимер N-ацетил-О-ацетил-маннозаминфосфата, а серогруппы С - полимер N-ацетил-О-ацетилнейраминовой кислоты. В 1969 г. немецкие ученые во главе с Е.Готшлихом разработали методы выделения и очистки указанных высокомолекулярных полисахаридов. Эти очищенные полисахариды были использованы для приготовления вакцины, которая оказалась весьма эффективной в тех случаях, когда возбудители относились к группам А и С. Позже для расширения спектра действия такой вакцины был приготовлен комплексный препарат, состоящий из очищенных капсульных полисахаридов не только групп А и С, но Y- и W-135.

До сих пор во всем мире для иммунопрофилактики широко используются только полисахаридные вакцины. Качество вакцины строго контролируется - определяются ее физико-химические параметры: молекулярные массы полисахарида, количественное содержание белка, нуклеиновых кислот, липополисахарида и т.д. По требованиям ВОЗ вакцина считается годной, если не менее чем у 90% вакцинированных по крайней мере четырехкратно увеличивается содержание в сыворотке соответствующих антител. В нашей стране выпускается в настоящее время только полисахаридная вакцина группы А, которая по всем параметрам не уступает зарубежным и предназначена для двух возрастных групп: от года до восьми лет и старше девяти. Недавно закончены государственные испытания отечественной полисахаридной дивакцины - серогрупп А и С. Полученные результаты позволили рекомендовать ее для использования в практическом здравоохранении.

Однако полисахаридные вакцины оказались непригодны для защиты детей грудного возраста и неэффективны в случае, когда инфекция вызвана менингококками серогруппы В. Чтобы полисахаридные вакцины групп А и С были эффективны и для детей до года, пытались "привязать" к полисахариду какой-нибудь активный белок, например столбнячный токсин. Такие препараты, называемые конъюгированными, были успешно испытаны на экспериментальных животных. Напомним, что в естественных условиях животные невосприимчивы к менингококку, и это создает большие трудности для предварительной оценки эффективности вакцинных препаратов. При искусственном заражении только у обезьян общая картина болезни наиболее близка к той, которая наблюдается у человека. Тем не менее такие не слишком дорогостоящие модельные животные, как мыши и кролики, широко используются для оценки целого ряда свойств иммунопрофилактических препаратов, например токсичности, характера иммунного ответа и т.д. Результаты проведенных испытаний конъюгированных вакцин внушают надежду: эти препараты оказались более иммуногенными, т.е. способными индуцировать большее количество антител у исследуемых животных. Кроме того, такое дополнительное введение белка позволило переключить иммунный ответ организма на выработку антител не только IgM, но и IgG класса, что очень важно для создания устойчивого иммунитета. Полевые испытания такой вакцины в районах с эпидемической ситуацией были включены в программы ВОЗ в 1990 г., - работы в этом направлении сейчас продолжаются.

В-МЕНИНГОКОККОВАЯ ВАКЦИНА

Начиная с конца 70-х годов во вспышках менингококковой инфекции начали лидировать именно менингококки серогруппы В. За последние 10 - 15 лет зарегистрирован относительный рост заболеваемости, обусловленной штаммами этой группы, в США, европейских странах, а также Аргентине, Бразилии, Колумбии, Кубе и Уругвае. В России заболеваемость менингококковой инфекцией серогруппы В в 1984 г. достигла 76.8%, а за последнее десятилетие снизилась (в частности в Москве до 56%). Однако нет оснований для благоприятных прогнозов, тем более что эта менингококковая инфекция протекает с особенно серьезными осложнениями, например, у 64% больных детей сильно нарушается неврологический статус. Полисахарид менингококка серогруппы В, как и С-полисахарид, представляет собой гомополимер N-ацетил-О-ацетилнейраминовой кислоты, но имеет другую пространственную структуру. В-полисахарид менингококка оказался непригодным для приготовления вакцины из-за своей низкой иммуногенности, обусловленной особенностями его структуры. Поэтому в течение последних 15 лет ведутся интенсивные поиски других эффективных антигенов для конструирования поливалентных вакцин. В частности, учитывается тот факт, что у больных, перенесших менингококковый менингит серогруппы В, обнаруживались антитела в основном IgG класса, к индукции которых, как правило, способны белковые антигены. Эти антитела обладали ярко выраженной бактерицидной активностью, т.е. способностью лизировать (разрушать) менингококки соответствующего штамма. Поэтому взоры ученых обратились к изучению различных белков менингококка с целью их использования в качестве протективных антигенов для приготовления менингококковой вакцины. Существуют три основных направления, по которым ведется конструирование менингококковой В-вакцины:

выделение высокоиммуногенного трехкомпонентного комплекса на основе белка, полисахарида и липополисахарида (этот комплекс присутствует в наружной мембране живой клетки менингококка, поэтому делаются попытки выделить его в максимально ненарушенном, нативном, состоянии и испытать в качестве вакцины);
выделение нативного комплекса, состоящего только из белков наружной мембраны менингококка в виде везикулярных образований с помощью "мягкой" экстракции детергентами;
выделение в индивидуальном, высокоочищенном состоянии не самого комплекса, а его отдельных компонентов и использование последних в различном сочетании для приготовления комбинированной вакцины.

Слабые стороны первого подхода связаны с трудностями выделения и хранения трехкомпонентного комплекса из-за нестабильности его состава. При разрушении такого комплекса может появляться свободный полисахарид серогруппы В. Это весьма нежелательно, поскольку он способен перекрестно реагировать с некоторыми антигенными образованиями в организме хозяина и потенциально индуцировать аутоиммунные антитела. Второй и третий подходы - наиболее перспективны; в последнее время они приобретают много сторонников. Так, группа американских и кубинских ученых во главе с К.Фрашем получила препарат, который оказался эффективным во время эпидемии менингита на Кубе в 1990 г. Вакцина содержала белки из наружной мембраны менингококка серогруппы В и С-полисахарид. Однако этот препарат защищал только от возбудителей, содержащих белки лишь вакцинного штамма. Группа европейских ученых недавно создала вакцинные препараты на основе белковых везикул, экстрагированных из наружной мембраны менингококка с помощью детергента - дезоксихолата натрия. По сравнению с кубинской вакциной эти препараты обладали более высокой иммуногенностью, широким спектром действия, но недостаточной эффективностью в отношении детей.

Таким образом, к настоящему времени еще не создана эффективная вакцина к менингококку серогруппы В. Поэтому продолжаются активные поиски оптимальных антигенов для ее конструирования.

БЕЛКОВЫЕ АНТИГЕНЫ

Наружная мембрана менингококка содержит большое количество различных белков. Их можно разделить на две группы: основные (количественно преобладающие) и минорные белки. В зависимости от величины молекулярной массы основные белки разделяют на пять классов. Примечательно, что содержание белков второго и третьего классов (их молекулярные массы лежат в пределах 37000 - 42000) достигает 50% от общего количества всех основных белков менингококка. Их называют типовыми, так как именно по ним проводят типирование данного штамма.

Сейчас насчитывается 18 серотипов менингококка, которые определяются специфичностью типового белка. Предполагается, что это порины - белки, образующие водные каналы в наружной мембране бактерии, по которым осуществляется транспорт молекул и ионов, необходимых для питания. Поскольку они количественно преобладают по сравнению со всеми другими белками наружной мембраны и играют важную роль для жизнедеятельности микроба, первые вакцинные препараты на основе белковых антигенов преимущественно содержали именно эти белки. Однако они оказались не достаточно эффективными.

Ведь идеальный белковый антиген для конструирования вакцины должен прежде всего обладать высокой иммуногенностью, т.е. индуцировать в организме человека усиленный синтез антител, причем антител бактерицидных, способных разрушать вторгшиеся в организм микробные клетки и защищать его от инфекции. Антитела к серотиповым поринам менингококка обладают защитным действием в незначительной степени, хотя, по последним данным, они могут быть важны для создания иммунологической памяти. Кроме того, серотиповой порин индуцирует только специфичные для данного штамма менингококка антитела, поэтому вакцина будет защищать именно от него. В связи с этим сейчас внимание исследователей привлекают белки менингококка первого, пятого классов и так называемые железорегулируемые.

Белки первого класса, как и серотиповые белки, - порины. По своей структуре они представляют собой тример, т.е. состоят из трех отдельных полипептидных цепей, образующих как бы связанные друг с другом "клубки" - домены. Молекулярная масса каждого домена колеблется в пределах 44000 - 50000. Хотя порины первого класса индуцируют антитела с достаточно высокой бактерицидной активностью, они обладают высокой антигенной изменчивостью. Поэтому, если включать такие белки в состав вакцины, она должна содержать набор поринов первого класса, выделенных из разных штаммов, т.е. быть "мультивалентной". Но есть и другой выход.

Оказалось, что внутри полипептидной цепочки белков первого класса есть несколько консервативных участков, повторяющихся независимо от штамма менингококка. Располагаясь на поверхности мембраны, такие идентичные участки (эпитопы) индуцируют одинаковые антитела. Таким образом, белки первого класса содержат ряд консервативных эпитопов, причем антитела к ним обладают бактерицидными свойствами. Поэтому, расшифровав точный химический состав пептидов, образующих такие эпитопы, можно получить их путем химического синтеза и использовать в качестве компонентов вакцины. Однако, чтобы такие пептиды начали вырабатывать соответствующие антитела, они должны иметь характерную петлеобразную структуру, как и в природной, нативной, молекуле белка. Кроме того, следует связать пептид с какой-нибудь высокополимерной молекулой, так как иммуногенностью обладают только большие полимерные молекулы. Таким образом, белки первого класса представляют большой интерес как потенциальные кандидаты для приготовления вакцины.

Не меньший интерес в этом отношении представляют белки пятого класса (молекулярные массы 26000 - 32000), обладающие очень высокой иммуногенностью. В сыворотках больных менингококковым менингитом содержание антител к таким белкам значительно повышено. Кроме того, у больных в стадии выздоровления в сыворотках присутствуют только эти антитела. Таким образом, по всем параметрам белки пятого класса - подходящие кандидаты на роль компонентов вакцины против менингококка. У них лишь один, но очень существенный недостаток - их вариабельность, т.е. изменчивость, причем они изменяются не только в зависимости от штамма, но даже внутри одного и того же штамма. Все белки пятого класса можно разделить на два основных подкласса, которые различаются по генетическим, биохимическим и иммунным свойствам. Первый подкласс включает в себя один более или менее стабильный Opc-белок. Он имеет постоянную величину молекулярной массы и кодируется одним opc-геном. Все остальные, высоко вариабельные, белки составляют Opa-класс и кодируются набором opa-генов. Оказалось, что Opa-белки - наиболее иммуногенны6. В их структуре есть общие, постоянные, "консервативные" участки аминокислотной последовательности, которые и ответственны за высокую иммуногенность. Поэтому по отношению к этим белкам должна быть, очевидно, применена тактика, описанная для белков первого класса: расшифровка пептидов, входящих в состав консервативных участков, последующий синтез и, наконец, "привязка" к подходящей высокомолекулярной основе.

Другими белками, представляющими не меньший интерес оказались железорегулируемые белки (ЖРБ) менингококка. Клеткам менингококка, как и большинству других микроорганизмов, необходимо, чтобы в среде, где они растут, содержалось железо. Его источниками для менингококка в человеческом организме могут быть лактоферрин, трансферрин и гемоглобин. Но в них железо очень прочно связано: в среднем из 1030 белковых молекул только одна распадается с образованием свободного, несвязанного иона железа. Иными словами, в условиях человеческого организма менингококк находится в очень стесненных обстоятельствах. Для того чтобы обеспечить себя необходимым для размножения и роста количеством железа, микроб начинает интенсивно синтезировать специальные конкурентноспособные белки-рецепторы, которые связывают свободное железо, транспортируют через мембрану и усваивают его. Такие белки и называются железорегулируемыми. Интенсивный синтез in vitro можно вызвать культивированием менингококка с низким содержанием железа. Подобное обеднение чаще всего создается введением специальных добавок, которые образуют с железом хелатные комплексы. Различные штаммы менингококка синтезируют набор ЖРБ, которые отличаются по молекулярной массе, свойствам и выполняют различные функции по усваиванию железа клеткой.

Процесс утилизации железа менингококком сложен и многостадиен, нам пока известно о нем очень немного. На основании целого ряда экспериментов сделано предположение, что на начальной стадии процесса усвоения железа из трансферрина действуют два комплексно-связанных белка: молекулярная масса одного из них (TbpA) постоянна (98000), а другого (TbpB) - варьирует в разных штаммах (65000 - 85000). Связав трансферриновое железо в тройной комплекс, эти белки передают его другому, периплазматическому белку с постоянной молекулярной массой (37000), задача которого - перенос железа через периплазматическое пространство далее, к цитоплазматической мембране.

Этот белок (ЖРБ-37) экспрессируется всеми штаммами не только менингококка, но и гонококка. Он относительно хорошо изучен по сравнению с другими ЖРБ, для него разработаны достаточно простые и доступные методы выделения7. Недавно удалось приоткрыть тайну его функционального центра, предназначенного для связывания железа. Оказалось, что он идентичен функциональному центру молекулы трансферрина беспозвоночных, в нем участвуют два остатка тирозина, гистидина и бикарбонатный анион. Как и трансферрин, ЖРБ-37 связывает железо обратимо и с очень высокой аффинностью (сродством). Предположили, что этот белок составляет как бы половину молекулы трансферрина, состоящего из двух доменов. Этому столь заманчивому предположению противоречит только сравнительно малая гомология аминокислотных последовательностей ЖРБ-37 и трансферрина.

Большой интерес представляет изучение иммунных свойств ЖРБ-37, так как это открыло бы широкие перспективы для создания вакцины не только против менингококковой, но и гонококковой инфекции. Антитела к этому белку обнаруживаются в сыворотках больных, но пока нет подробных статистических данных. Любопытно, что специфические антитела к нему регистрировались лишь в антименингококковых сыворотках мышей и кроликов, но не в антисыворотках к другим патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Очевидно, этот белок специфичен лишь для патогенных представителей рода Neisseria. Многообещающим кандидатом для создания вакцины может быть и упомянутый трансферриновый рецептор TbpB, молекулярная масса которого для большинства штаммов составляет около 70 000. Этот белок индуцирует бактерицидные антитела, консервативен для некоторых штаммов, и антитела к нему обнаружены у большинства больных менингококковой инфекцией.

Интересные данные получены недавно в нашем институте. Выяснилось, что один из упоминавшихся ЖРБ с молекулярной массой 70 000 и серотиповой белок с молекулярной массой 40000 имеют общие эпитопы с белками Branhamella catarrhalis - микроба, вызывающего отиты, конъюктивиты и инфекции респираторного тракта. Следовательно, если удастся расшифровать и синтезировать общие эпитопы, то принципиально возможна разработка вакцины против комплекса тяжелых инфекционных заболеваний.

ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫЙ АНТИГЕН

Известно, что липоолигосахарид (ЛОС) клеточной стенки менингококка обладает иммуногенностью и содержит антигенные детерминанты, одинаковые не только у разных штаммов менингококка, а, как предполагается, и у других грамотрицательных бактерий. ЛОС менингококка рассматривается как перспективный антиген для конструирования менингококковой вакцины. Однако липоолигосахарид высокотоксичен за счет липидной части молекулы. Если удалить липид А из молекулы ЛОС, токсичность молекулы резко снижается, но - увы! - одновременно снижается и его иммунная активность. Поэтому сейчас разрабатываются другие способы нейтрализации токсичного действия липида А. Один из них - попытка включения его в липосомы, которые связывают именно липидную часть молекулы ЛОС менингококка. Эксперименты, проведенные на животных, это подтвердили, и оказалось, что токсичность связанного липосомами ЛОС снижалась в несколько раз, а его иммуногенность даже несколько увеличивалась, например, появлялась способность вырабатывать антитела не только IgM, но и IgG класса. Эти многообещающие данные сейчас уточняются, работы ведутся на биотехнологическом уровне в плане синтеза лишенных токсичности компонентов ЛОС, изучения иммунного ответа и оптимальной конструкции липосом.

Почти 30 лет ученые упорно сражаются с возбудителем менингококковой инфекции, но, к сожалению, - эффективной вакцины, способной надежно защитить человека от этого заболевания, пока не создано. Сейчас существуют только вакцины, направленные против штаммов менингококка серогрупп A, C, Y, W-135. Оказалось, что наших знаний об основных антигенах менингококка недостаточно. Необходимо еще изучить связь между структурными и функциональными особенностями белков, входящих в состав наружной мембраны микроба, определить и охарактеризовать их иммуногенные эпитопы и т. д.

Нельзя не согласиться с мнением голландского ученого Я.Пульмана, считающего, что В-менингококковая вакцина должна быть многокомпонентной и в ближайшем будущем ее можно будет приготовить на основе трех основных антигенов: нативных белковых везикул (содержащих в основном два наиболее иммуногенных белка первого и пятого классов), лишенного токсичности липополисахарида и железорегулируемого белка менингококка с молекулярной массой 70 000. Все это очень разумно и не вызывает возражений, за исключением предложения ввести в вакцину только один ЖРБ - рецептор трансферрина. Нам кажется, что для расширения защитных свойств в вакцину следует включить аналогичные рецепторы лактоферрина и какой-нибудь из низкомолекулярных трансферриновых рецепторов. Видимо, такая многокомпонентная вакцина может быть использована и для профилактики гонококковой инфекции. Кроме того, если включить очищенные ЖРБ в уже существующие полисахаридные вакцины, можно усилить их эффективность и расширить действие на В-менингококковые штаммы. Дальнейшие пути совершенствования вакцины, очевидно, связаны с применением новых биотехнологических методов для создания синтетических вакцин. Будем надеяться, что в XXI в. эта проблема будет решена.

Март 1998