VIVOS VOCO: И.А. Захаров, Е.В. Шайкевич, Н.В. Ившин, "ДНК-штрихкодирование в энтомологии"

№9, 2007 г.

ДНК-штрихкодирование в энтомологии

И.А. Захаров, Е.В. Шайкевич, Н.В. Ившин

Илья Артемьевич Захаров, член-корр. РАН, гл. научн. сотр. Ин-та общей генетики РАН им.Н.И.Вавилова
Елена Владимировна Шайкевич, канд.биол. наук, ст. научн. сотр. того же института.
Николай Викторович Ившин, канд. биол. наук.

Любая технология в своем развитии неизбежно проходит определенные этапы: от научного открытия или изобретения через многочисленные варианты его возможного практического применения к стандартизации, промышленному внедрению и использованию в производстве или быту. Технология не возникает на пустом месте. Она всегда базируется на фундаментальных научных исследованиях. Цивилизованное общество в состоянии осознать, что и сама по себе наука представляет большую ценность. Недостаточно цивилизованное опосредованно вкладывает деньги в развитие науки своих соседей, импортируя их технологии, если это хоть сколько-нибудь дешевле в краткосрочной перспективе. Так или иначе, но новая технология - это то, в чем нуждается любое человеческое общество. Она позволяет ему лучше удовлетворять свои биологические потребности в пище, одежде, жилье и воспроизводстве себе подобных. Достаточно сытое общество обычно требует не только хлеба, но и зрелищ. В этом случае для технологий находятся дополнительные приложения. Здесь хочется вспомнить изречение Козьмы Пруткова: “Гений мыслит и создаёт. Человек обыкновенный приводит в исполнение. Дурак пользуется и не благодарит”. В конечном счете, новые технологии позволяют расширить занимаемую человеком экологическую нишу и обеспечить более высокую биологическую продуктивность человеческой популяции, эффективнее трансформировать окружающую среду “под себя”, при этом нередко разрушая естественные природные местообитания других биологических видов, порой уничтожая их полностью. Однако разработка технологии - занятие часто достаточно неинтересное для человека с академическим складом ума, порой оно претит его этическим и эстетическим чувствам по отношению к природе, и его участие в этом - своеобразная плата обществу за потраченные на ученого средства.

Редок тот счастливый случай, когда нет столкновения интересов, т.е. когда и наука, и бизнес, и общество получают полезный инструмент для реализации своих целей. Подходящий пример такой ситуации - ДНК-штрихкодирование. Эта новая, интенсивно развивающаяся технология (в англоязычной литературе DNA BARCODING) может иметь необычно широкое применение. Основывается она на двух выдающихся достижениях молекулярной биологии, в свое время отмеченных Нобелевскими премиями: во-первых, на методах определения последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК (ее секвенирования); во-вторых, на полимеразной цепной реакции, которая благодаря способности ДНК к репликации позволяет накопить (амплифицировать) выбранный фрагмент ее молекулы в количествах, пригодных для дальнейшего анализа. Основная идея ДНК-штрихкодирования заключается в том, что некий достаточно короткий стандартный участок ДНК может играть роль уникального маркера, позволяющего однозначно (или почти однозначно, так как существует внутривидовая изменчивость) определить видовую принадлежность организма подобно тому, как работает штрихкод на упаковке, который считывается сканером при оплате товара. Новая технология оказалась востребованной во многих областях биологии, таких как систематика, эволюционная биология, оценка и сохранение биоразнообразия. Неудивительно, что в результате появился крупный международный проект “ДНК-штрихкод жизни”.

В 2003 г. канадский ученый П.Хеберт предложил использовать ДНК-штрихкодирование для видовой идентификации особей, включая трудно определяемых, поврежденных и находящихся на личиночной стадии развития, с помощью короткой стандартной последовательности цепи ДНК [1, 2]. Эта идея сразу привлекла внимание многих систематиков, генетиков и эволюционных биологов. В 2003 г. прошли первые лабораторные тренинги “ДНК и таксономия” и “Таксономия, ДНК и штрихкод жизни”, спонсированные фондом “Alfred P.Sloan Foundation”. Они показали, что предложенная технология недорога, удобна и позволяет даже неспециалистам проводить точную идентификацию организмов, что усиливает значимость таксономических исследований за пределами академических учреждений, например в агрономии, в здравоохранении, в образовании и во многих других сферах общества. В качестве маркера, выполняющего роль штрихкода, выбрали последовательность ДНК, кодирующую первую субъединицу митохондриальной цитохром-оксидазы (ген этого дыхательного фермента находится в митохондриальной ДНК).

В 2004 г. при поддержке вышеупомянутого фонда образовался консорциум Штрихкод Жизни (Consortium for the Barcode of Life). Через два года общая стоимость проекта составила более 2 млн долл. США. Активное участие приняли государственные и частные фонды Канады: “Canada Foundation for Innovation” и “Ontario Innovation Trust” спонсировали строительство Института биоразнообразия в Онтарио при университете “University of Guelph” для размещения лабораторий по ДНК-штрихкодированию. Фонд “Gordon and Betty Moore Foundation of California” профинансировал выделение и идентификацию 225 тыс. ДНК-последовательностей из организмов разных таксономических групп. Фонд “Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada” обеспечил создание канадской компьютерной сети для 40 специалистов по ДНК-штрихкодированию из университетских и правительственных лабораторий. В сети находится база данных по 10 тыс. канадским видам. Фонд “Genome Canada” поддержал исследования по ДНК-штрихкодированию грибов, растений и протистов.

В связи с тем что ресурсы проекта достаточно большие, но все же ограниченные, было предложено сфокусировать усилия на нескольких направлениях. Так, программа “All Leps” нацелена на изучение бабочек двух хорошо известных семейств: павлиноглазок и бражников Америки и Австралии. Сюда же вошли региональные исследовательские программы “Чешуекрылые Национального парка Great Smoky Mountains” (США) и “Area de Conservaciуn Guanacaste” (Коста-Рика). Направление “Fish-Bol” связано с глобальным изучением рыб мировой фауны, а “ABBI” посвящено исследованию мировой фауны птиц. Существуют также и канадские программы “Canadian Biota” и “Barcoding of Canadian Arctic” по всем видам животных, грибов, лишайников и морских водорослей соответствующих регионов. Штрихкодирование фауны рыб найдет непосредственное использование в рыболовстве, охране биологических ресурсов и в торговле морепродуктами.

Большая группа проектов с публичным доступом к данным сосредоточена на сервере http://www.boldsystems.org. В частности, для энтомологов интересен сервер http://www.lepbarcoding.org, где для картирования точек сбора материала используется геоинформационная система Google. Она связана с базами данных последовательностей ДНК первого сервера (табл.), а также базой фотоизображений соответствующих особей и онлайновой системой идентификации.

Подобная эффективность, достигнутая менее чем за четыре года исследований, вероятно, объясняется еще и тем, что молекулярная систематика переживает революцию, которая скорее всего в недалеком будущем приведет (а где-то уже привела) к глобальному пересмотру филогении для многих крупных таксонов. Благодаря молекулярной генетике обнаружены новые таксоны и даже формы жизни, как, например, археи. Результаты сравнения ДНК крупных таксонов указали на родство между круглыми червями и насекомыми. Как выяснилось, это не единственное свидетельство: имеется сходство в механизмах линьки, а также в устройстве нервной системы, чему ранее не придавали большого значения. Новые палеонтологические данные показали, что в процессе эволюции сегментация тела у беспозвоночных возникала неоднократно и потому не может лежать в основе установления эволюционного родства между таксонами высокого ранга. Таким образом, происхождение насекомых от полихет поставлено под сомнение.

Накопившаяся база по последовательностям ДНК разных организмов, развитие компьютерных алгоритмов анализа последовательностей, а также рост производительности самих компьютеров привели к тому, что исторический подход стал возможен не только в палеонтологии. Известно, что некоторые консервативные области генома схожи у большинства видов. Благодаря этому удается сравнивать морфологически несопоставимые организмы, а по степени накопления мутаций в таких областях характеризовать величину различий как между видами, так и между таксонами более высокого ранга, проводить реконструкцию эволюционного процесса.

Признание исторического подхода в молекулярной биологии привело и к смене философской основы эволюционных построений: наметился переход от позитивизма к неопозитивизму. Явное обращение к философским корням прослеживается во многих современных работах по молекулярной систематике, где, например, часто говорят не о филогенетическом дереве, а о дереве парсимонии (parsimony tree), т.е. о дереве сходства, а не родства. Для того чтобы оно стало истинным филогенетическим деревом, необходимо в нем выделить узел, соответствующий прародительской форме, т.е. “укоренить” дерево. Кроме того, возможен второй подход, также известный из классического филогенетического анализа, где выделяют древние (плезиоморфные) и современные (апоморфные) признаки и учитывают эту информацию при поиске корневого узла дерева. На молекулярных данных реализация второго пути, характерного для классической филогении, основанной преимущественно на морфологических данных, вряд ли возможна.

ДНК-штрихкодирование - это вполне закономерный подход, вытекающий из современных методологических и философских представлений в биологии. Он не претендует на знание того, каким путем шла эволюция, но позволяет точно различать виды и устойчивые субвидовые группировки.

Взрослые бабочки из семейства бражников и их гусеницы:
1 - молочайный бражник (H.euphorbiae),
2 - южный молочайный бражник (H.nicaea),
3 - шмелевидка хорватская (H.croatica).
Даже для специалиста различить два первых вида на стадии имаго трудно.
Здесь и далее фото Н.В. Ившина

Для иллюстрации приведем здесь фрагмент нашей работы с использованием технологии штрихкодирования при изучении систематики насекомых, в частности трех европейских видов бабочек семейства бражников [3]. Среди них наиболее интересен молочайный бражник Hyles euphorbiae - вид, обладающий большим популяционным разнообразием. Это стало причиной выделения внутри него нескольких подвидов. Ареал молочайного бражника охватывает всю Европу, прерываясь на севере приблизительно в районе 60-й параллели, а на востоке проходит по Казахстану, Таджикистану и Киргизии.

Южный молочайный бражник Hyles nicaea встречается на территориях Северной Африки, Южной Европы, Закавказья, Средней Азии. По опубликованным ранее молекулярно-генетическим данным в роде Hyles он более всего схож с предыдущим. Однако морфологически он гораздо менее разнообразен и подразделение его на подвиды не столь очевидно.

Третий вид - шмелевидка хорватская Hemaris croatica - обитает в основном в некоторых районах Южной Европы и Закавказья; найден также в Турции и Юго-Восточном Иране. Изменчивость вида невелика и ареал достаточно мал. Согласно последним ревизиям семейства, подвиды у хорватского бражника не выделяют. Эта бабочка принадлежит к совершенно другой трибе и другому роду, но к тому же подсемейству Macroglossinae, что и предыдущие два вида. Таким образом, шмелевидка хорватская может служить своеобразным контролем: ее отличие от видов Hyles должно быть очевидным, но не настолько большим, чтобы на их фоне различия между молочайными бражниками стали вообще незаметными.

ДНК-последовательности по 29 экземплярам бабочек получили из представленной в сети Интернет базы данных NCBI: 28 - для H.euphorbiae из центральных и южных районов Западной Европы (морфологически и географически эти бабочки соответствуют номинативному подвиду), и один - для H.nicaea из Северной Африки. Четыре бабочки собрал один из авторов, Ившин (три из них - на Украине в Западном Крыму, одну - на юге Московской обл.). Оба места сбора сильно удалены территориально от мест сбора насекомых, данные по которым взяты из базы NCBI. У каждого из четырех экземпляров бабочек ДНК выделяли из ножки. Таким образом, насекомое оставалось почти неповрежденным, что очень важно для коллекционеров.

Используя стандартную методику, предложенную в рамках программы “Штрихкод жизни”, мы установили последовательности ДНК для выбранных четырех экземпляров. Методологическая структура подобных проектов включает следующие этапы:

1. Подбор экземпляров: музейные коллекции, гербарии, зоопарки, аквариумы, коллекции замороженных тканей, банки семян, коллекции типовых культур и другие источники идентифицированных организмов.
2. Лабораторный анализ проводится согласно стандартной методике (пропись можно посмотреть в Интернете *. Сюда входит выделение, амплификация и секвенирование последовательностей ДНК. Установленная последовательность сохраняется в базе данных.
* http://barcoding.si.edu/PDF/Protocols_for_High_Volume_DNA_Barcode_Analysis.pdf
3. База данных играет ключевую роль, так как служит доступным справочником идентифицированных организмов. Сегодня роль таких баз данных играют “Nucleotide Sequence Database of the European Molecular Biology Lab” в Германии и “DNA Data Bank of Japan” в Японии. Они соответствуют стандартам “Штрихкод Жизни”, опубликованным в Интернете *.
* http://barcoding.si.edu/PDF/DWG_data_standards-Final.pdf
4. Анализ результатов заключается в поиске образца ДНК в базе данных, наиболее схожего с ДНК идентифицируемого организма. На основании обнаруженных различий при помощи различных математических алгоритмов строятся деревья сходства, которые далее используются в филогенетическом анализе. Специальная рабочая группа занимается поиском лучших путей анализа результатов ДНК-штрихкодирования, а также их представления и дальнейшего использования.

У изученных экземпляров бабочек мы установили часть последовательности гена первой субъединицы митохондриальной цитохром-оксидазы, длина которой составила 612 нуклеотидных пар. Построенное с помощью алгоритма Neighbor-Joining линеаризованное дерево показывает степень сходства анализируемых особей с представленными в базе данных. Особи H.nicaea заметно отличаются от H.euphorbiae, а экземпляр H.croatica, как и ожидалось, стоит особняком от всех остальных.

Экземпляры H.nicaea castissima и H.nicaea orientalis достаточно хорошо различаются, но эти различия не настолько сильны, как у двух изученных видов Hyles. Можно предположить, что H.nicaea castissima и H.nicaea orientalis действительно заслуживают статуса подвидов.

Дендрограмма, показывающая степень сходства исследуемых особей с базовыми данными.
Под черным треугольником - слагающие ветви, характеризующие отдельных особей.

У H.euphorbiae наблюдается три наиболее четко выраженных кластера. Первый, в котором оказалось большинство бабочек, соответствует европейскому подвиду H.euphorbiae euphorbiae. Сюда вошли особи из популяций Германии, Франции, Италии, Испании, Турции, Армении и Казахстана. В этот же кластер попал и экземпляр из приокской подмосковной популяции. Второй и третий кластеры образованы одним испанским и одним крымским экземплярами H.euphorbiae. Можно предположить, что крымская популяция в силу географической изоляции действительно отличается от других европейских. Эти различия приближаются к подвидовым, найденным у H.nicaea. Для проверки данной гипотезы требуются исследования на материале большого объема. Ситуация с испанским экземпляром гораздо менее ясна, так как для него нет точных данных о месте сбора, и вопрос о принадлежности его популяции к какому-либо географическому или экологическому изоляту остается открытым. Стоит заметить, что остальные семь экземпляров из Испании попали в первый кластер.

Показанное выше - не более чем пример возможного применения технологии ДНК-штрихкодирования. Для получения статистически надежных результатов, относящихся к систематике бражников, и для анализа их внутривидовой изменчивости нужны гораздо большие выборки. Но уже сейчас видно, что методика, предложенная мировому сообществу биологов, действительно успешно работает.

Литература

1. Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., Dewaard J.R. // Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2003. V.270. P.313-321.

2. Hebert P.D.N., Ratsingham S., Dewaard J.R. // Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2003. V.270. P.596-599.

3. Danner F., Eitschberger U., Surholt B. // Die Schwarmer der westlichen Palaearktis. Herbipoliana. Buchreihe zur Lepidopterologie. Band 4/1. Marktleuthen, 1998.